ニトロソアミンのEnhanced Ames test：多施設研究からの重要な知見

ICH M7(R2)ガイドライン（2023年）は、OECD 471に準拠して実施される細菌を用いた復帰突然変異試験（Ames試験）を、ニトロソアミンを含む医薬品不純物の変異原性を評価するための主要ツールとして引き続き推奨しています。Ames試験は一般的にげっ歯類に対する発がん性を予測するものの、標準条件下での感度、特に代謝活性化に10%ラットS9を用いる場合の感度については懸念が残っています。

こうした懸念に対処するため、規制当局は現在、Enhanced Ames Testプロトコルの使用を推奨しています。

Bercuらによる最近の研究は、Regulatory Toxicology and Pharmacology誌に掲載され、ニトロソアミンに対するAmes試験の最適化における大きな進歩を示しています。この論文では、HESI Genetic Toxicology Technical Committee（GTTC）が実施した、試験の性能と解釈の改善を目的とした多施設Ring Trialの詳細が示されています。

研究内容
研究者らは、幅広い化学構造と既知の発がん性を示す29種類のニトロソアミンと3種類のN-ニトロソ薬物類似化合物を評価しました。これらの化合物は、代謝活性化を最大化し、変異原性検出を向上させるために設計された、30分間のプレインキュベーションプロトコルを用いて、5種類の細菌株を用いて試験されました。

主な知見
１．最適化されたS9条件による感度の向上
本研究では、Ames試験においてハムスター肝臓S9を30%使用することで、変異原性ニトロソアミンの検出感度が大幅に向上し、90%に達することが明らかになりました。ラットS9とハムスターS9をそれぞれ30%使用した場合、それぞれの結果を個別に試験し、それらを統合して最も保守的な推定値を得たところ、感度はさらに93%に向上しました。しかし、この改善は特異度の低下を伴い、約45%に低下しました。これは、試験の最適化におけるトレードオフと、適切な代謝活性化系を選択することの重要性を浮き彫りにしています。

２．メカニズムの洞察により誤検知が減少
研究者らは、代謝活性化なしで陽性反応を示す化合物（-S9）など、直接的なDNA相互作用とは無関係なメカニズムによって変異原性を示す化合物を除外することで、試験の特異性が向上したことを指摘しました。これは、特に規制当局への申請において、Ames試験の結果を解釈する際、その作用機序を理解することの重要性を改めて示すものです。 代謝活性化条件 (+S9) 下で陽性反応を示した化合物については、Derek Nexus が潜在的な代替作用機序の調査をサポートします。

３．高品質の発がん性データの活用
この研究において極めて重要だったのは、 Lhasa Carcinogenicity Database（LCDB）の活用でした。各化合物はラーサの信頼性スコアリングシステムを用いて評価され、非発がん性物質の確実な分類と、試験結果の解釈における不確実性の低減を可能にしました。この厳選された高品質なデータリソースは、確固としたエビデンスに基づく結論を導き出す上で重要な役割を果たし、業界と規制当局の両方のリスク評価を支援しました。

なぜこれが重要なのでしょうか
この共同研究は、高品質なデータとメカニズムの洞察に裏付けられた、慎重に最適化された試験条件によって、ニトロソアミンに対するAmes試験の予測を大幅に向上できることを実証しました。具体的には以下のとおりです。
・　感度が高まれば、変異誘発リスクの検出が向上します。
・　特異性の向上により偽陽性が減少し、不必要な追跡検査を回避するのに役立ちます。
・　LCDB のような信頼できるデータベースは、特に否定的な結果の場合、結果の信頼性を高めます。

これらの進歩により、Ames試験は医薬品不純物の安全性評価において、ロバストかつ規制に適合したツールであり続けることが保証されます。

フルペーパー
ニトロソアミンの調和されたAmes試験に関する、HESI GTTC出版物をご覧ください。この出版物は、陰性結果への高い信頼性と、規制上の意思決定に役立つ貴重な洞察を提供します: HESI GTTC ring trial: Concordance between Ames and rodent carcinogenicity outcomes for N-nitrosamines (NAs) with rat and hamster metabolic conditions 

Derek NexusとSarah Nexusがニトロソアミン評価をどのようにサポートできるかご興味がありましたら、ぜひお問い合わせ下さい。

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